細菌生物膜是大量存在的三維活性物質，具備執行復雜的生物力學和生物化學功能的能力，包括可編程生長、自我修復、過濾以及生物生產。然而，***直以來，都缺少能夠在細胞尺度上具備空間分辨率的在體測量生物膜內部力學特性的方法。在此，在不同的應力振幅、周期和生物膜大小的各種條件下，在施加剪切應力期間和之后，對霍亂弧菌的活體三維生物膜內的數千個細胞進行了追蹤，這揭示了細胞位移和細胞重新定向的各向異性彈性和塑性響應。利用細胞追蹤來推斷通用力學模型的參數，獲取了生物膜內部彈性模量的空間分辨測量值，其與生物膜基質內多糖的空間分布存在關聯。此處引入的無創微流變學和力推斷方法為研究活體材料中具有高空間分辨率的力學性能提供了***個通用框架。

據估計，細菌生物膜群落乃是地球上***為豐富的生物材料，且在人類健康領域發揮著重要作用，涵蓋從腸道微生物組到各類感染。于生物工程和材料科學中，生物膜當下正作為典型的可編程多功能活性材料而被深入探究，其整合了機械穩固性與適應性，以及自我修復和化學合成的能力。盡管生物膜是具備廣泛技術潛能的材料，然而在醫療場所和工業管道里，細菌生物膜亦可能構成問題，因為它們對于抗生素、消毒劑和機械應力具有高度的耐受性。故而，控制生物膜的生長和機械性能對于技術應用以及清除感染和工業中不受歡迎的生物膜而言，乃是重要的挑戰。

生物膜通常為在表面生長的三維結構，其生長方式或是消耗表面內的營養物質，或是消耗表面上方水相中的營養物質。在細菌生物膜中，細胞借助由蛋白質、核酸、多糖和脂質構成的自身產生的細胞外基質彼此相連并附著于表面，共同形成***種復雜且具備機械彈性的材料結構。不同細菌物種的生物膜，其基質的確切分子組成存在差異。生物膜去除所具有的工業和醫學重要性致使針對宏觀尺度（100 μm - 10 cm）下整個生物膜的整體材料特性展開了多項研究，明確了特定基質成分的重要作用。依據生物膜的整體材料特性，強流體流動已被證實會顯著改變生物膜的形狀，包括對于產生粘彈性生物膜的細菌物種形成生物膜飄帶。

盡管針對整個生物膜的全球材料屬性已獲取了重要的洞見，但對于生物膜內材料屬性的空間分布及其后果卻知之甚少。對生物膜中基因表達的空間分辨測量顯示，在細胞長度尺度上存在顯著的生理異質性。再者，生物膜內部的基質成分在細胞長度尺度上也存在變化。生物膜中的機械性能很可能在細胞長度尺度上也有差異，然而在這些微觀尺度上，基質成分的空間分布與局部材料屬性之間的關系仍未可知。 

為探究生物膜內部具有空間分辨率的材料特性，此前的研究已在生物膜內部置入微觀珠子。珠子的被動擴散或在主動擾動后的位移，可用于推斷珠子周邊的機械環境。與置于生物膜內的微珠不同，細菌細胞通過其細胞表面自身產生的蛋白質和多糖，錨定在細胞外生物膜基質上并彼此相連。因此，相較于微珠，細菌細胞或許能更***地示蹤生物膜內部的局部材料特性。基于這***理念，我們試圖以細胞分辨率無創地測量 3D 細菌生物膜的局部機械特性。為達成此目的，我們將高度可重復的微流控生物膜培養系統與流量控制，同 3D 活細胞顯微鏡技術的***新進展以及基于深度學習的高精度細胞檢測圖像分析相耦合。

我們的實驗平臺能夠讓我們在各種不同的剪切速率振幅、暴露時長以及生物膜尺寸的廣泛范圍內，追蹤霍亂弧菌 3D 生物膜中的單個細胞在強流體剪切期間及之后的情況。為重構生物膜的內部材料特性，我們研發了***種計算推斷方法，用于從細胞追蹤數據估算彈性力。依據實驗中的細胞坐標變化，我們還能夠以細胞分辨率量化生物膜內部的可塑性，其被定義為生物膜在暴露于流體剪切前后結構上的差異，這可由細胞位置和方向的改變來確定。我們的測量結果揭示了生物膜中機械剛度的空間分布與細胞外基質特定分子成分的空間分布之間存在關聯。除了提供細菌生物膜內部局部彈塑性應力響應的精細分辨圖像之外，在此開發的綜合實驗和計算方法能夠為細胞水平分辨率下生物材料的無創流變學分析奠定基礎。

為了研究生物膜的機械性能，我們在微流體通道中培養霍亂弧菌生物膜，從單個細胞生長到 521 - 9554 個細胞的群落規模，其中***大的細胞數量對應的生物膜菌落近似半球形，直徑為 50 微米，高度為 17 微米，體積為 5246 微米3。在生物膜培養期間，細胞在極低的剪切速率（通道底面處的剪切速率為 20.4 秒?1）下持續暴露于***小 M9 培養基的恒定流動中，這種環境條件導致生物膜內細胞的中位體積為 0.5 微米3。然后我們停止流動，并進行了以下實驗。我們獲取了生物膜中所有細胞的三維高分辨率圖像，然后提高微流控通道中的流速，以獲得剪切速率 = 8.16×10^4 s^?1（通道中的平均流速：uaverage = 0.95 m s^?1），然后我們又獲取了另***幅三維圖像。在施加這種強剪切速率特定時間（3 - 40 分鐘）后，我們再次停止流動，并獲取了生物膜的***終三維高分辨率圖像。

圖1，生物膜因剪切流變化引起的變形、恢復和可塑性。A）在微流控通道中附著于玻璃表面的霍亂弧菌生物膜菌落（5013 個細胞，V = 3891 μm3）在單細胞水平上進行了 3D 成像，以追蹤強剪切流（剪切速率 8.16 × 10? s?1）作用引起的結構變化。根據細胞與 z 軸的角度對細胞進行著色。第***個 3D 圖像時間點稱為“之前”，是在通道中無流動的情況下獲取的。獲取第***個 3D 圖像后，流速從 0 增加到 2000 μL min?1 并保持***定時間（3 - 40 分鐘）。第二個 3D 圖像時間點稱為“變形”，是在強流沿 x 軸施加 1 分鐘時獲取的。第三個 3D 圖像時間點稱為“之后”，是在強流再次停止 1 分鐘后獲取的。在本研究中，我們將前兩個時間點之間的生物膜結構變化稱為“變形”，后兩個時間點之間的稱為“恢復”，第***個和***后***個時間點之間的稱為“可塑性”。B）基于兩個時間點之間的 3D 擬共形映射，使用細胞質心坐標計算生物膜變形（左）、恢復（中）和可塑性（右）的應變場幅度（I1 = εxx + εyy + εzz）。來自 n = 9 個獨立重復生物膜的平均結果顯示在***個半橢圓形區域上，為了可視化內部，去除了四分之***。C）生物膜變形，在 xz 平面（上）和 xy 平面（下）可視化：流體剪切速率從 0 增加到 8.16 × 10? s?1 引起的平均細胞位移的矢量場。對于 xy 平面矢量場，包括所有 z 坐標處的細胞位移進行平均。對于 xz 平面矢量場，包括所有 y 坐標處的細胞位移進行平均。D）生物膜恢復，在 xz 平面（上）和 xy 平面（下）可視化：流體剪切速率從 8.16 × 10? 降低到 0 s?1 后平均細胞位移的矢量場。E）生物膜可塑性，在 xz 平面（上）和 xy 平面（下）可視化：平均細胞位移的矢量場。在（C - E）中，位移矢量λ的單位在所有圖中是***致的，但按每個圖的插圖所示進行了縮放。對于（C - E），使用了來自 n = 87 個獨立重復生物膜的數據，***先通過將每個生物膜的大小按半徑 R 進行歸***化，然后在所有生物膜中對大小為 0.05×R 的空間箱中的細胞位移進行平均。

利用細菌單細胞分割以及***個涉及應變場計算的迭代跟蹤算法（圖 1B），該算法是專門為我們實驗生成的圖像數據集開發的（見實驗部分；以及支持信息中的圖 S1），我們在所有三個時間點跟蹤了 274 個獨立的生物膜中的細胞。基于這些細胞軌跡，我們計算了在將剪切速率從 0 增加到 8.16×10^4 s^?1 引起的生物膜變形期間（圖 1C），以及在將剪切速率從 8.16×10^4 降低到 0 s^?1 引起的生物膜恢復期間（圖 1D）的細胞位移。通過將生物膜恢復后的細胞位置與其初始位置進行比較，我們能夠研究并量化局部生物膜的可塑性（圖 1E）。在恢復期間，細胞位移的大小（但方向相反）與變形期間的細胞位移相似，導致流量降低后的生物膜形狀看起來與流量增加前的生物膜形狀相似。然而，在變形和恢復期間，***些***外層的細胞已被撕裂，并且剩余附著的細胞存在凈細胞位移。總之，這些結果表明生物膜表現出較大的彈性響應，塑性成分較小（圖 1C - E）。

Video 1: 在剪切速率從 0 增加到 4.08×10^4 s^-1 ，然后再降低回 0 s^-1 的過程中對霍亂弧菌生物膜變形的可視化。該視頻包含 81 個時間點，在每個時間點，我們獲取了***個 z 間距為 400 納米的完整共聚焦 3D 圖像。在每個成像時間點，剪切速率是恒定的。然而，在每個成像時間點之間，剪切速率會增加或降低：在時間點 1 - 41 之間，剪切速率從 0 以 0.102×10^4 s^-1 的增量增加到 4.08×10^4 s^-1 ；在時間點 41 - 81 之間，剪切速率從 4.08×10^4 以 0.102×10^4 s^-1 的增量降低到 0 s^-1 。為了盡可能減少光暴露和光損傷，我們通過向流入的 M9 培養基中添加***種 DNA 結合染料（Syto 9 綠色熒光核酸染色劑，5 μmol/l，西格瑪），從細胞中產生了高熒光信號。在生物膜變形期間的多個時間點獲取 3D 圖像使我們能夠更容易地追蹤細胞。然而，我們注意到，長時間暴露于 DNA 結合染料會導致生物膜大幅軟化，這使得該技術無法常規用于表征生物膜的機械性能。

圖2，生物膜的結構在變形、恢復和可塑性過程中在細胞層面發生變化。A）本研究中坐標的示意圖：流動沿 x 軸方向；灰色半球表示生物膜形狀；在流動之前、期間和之后的細胞質心 xyz 坐標分別描述為 r1、r2 和 r3。B）θz 的定義和沿細胞主軸的單位向量 n 的示意圖，用于局部向列序參數 Sk 的定義，該參數是針對所有索引為 l ∈ L 且位于索引為 k 的焦點細胞表面 1.8 μm 范圍內的細胞計算的。C）生物膜變形、恢復、可塑性的側視圖（xz 平面），針對四個單細胞層面的結構參數（Δr，位移；(r × Δr)y，角動量類位移叉積的 y 分量；Δθz，細胞主軸與 z 軸夾角的變化；ΔS，局部向列序參數的變化）。D）生物膜變形、恢復、可塑性的頂視圖（xy 平面），針對四個結構參數（Δr，r × Δr，Δθz，ΔS）。在（C）和（D）圖中，對 n = 13 個獨立的生物膜的生物膜結構變化進行了測量，這些生物膜體積 V > 2800 μm3，暴露于剪切速率  = 8.16 × 104 s?1 持續 20 或 40 分鐘。

單細胞水平生物膜結構參數的測量結果表明，在變形和恢復細胞位移***大的位置，塑性細胞位移***大。然而，與變形和恢復細胞位移相比，塑性細胞位移相對較小。相比之下，細胞取向和向列序參數的塑性變化與變形和恢復過程中這些參數的變化幅度相似。

圖3，相圖展示了***大流速和生物膜體積對生物膜變形、恢復和可塑性過程中結構變化的影響。A）變形過程中的生物膜結構變化。每個熱圖顯示了***大流速和生物膜體積 V 對生物膜結構參數（Δr，細胞位移；|(r×Δr)y|，類似角動量的位移叉積；|Δθz|，細胞與 z 軸排列的變化；|ΔS|，局部向列序的變化）的影響。熱圖中的每個像素是在此條件下所有生物膜中所有細胞的平均值。B）恢復過程中的生物膜結構變化（將剪切速率從***大值降低回 0 s?1 之后）。C）表征可塑性的生物膜結構變化。對于每個熱圖中的每個像素，來自 n≥3 個獨立復制生物膜的數據取平均值。

為了確定我們系統的哪些特性會影響生物膜結構變化的幅度，我們對不同體積的生物膜、不同的***大剪切速率以及在***大剪切速率下的不同暴露持續時間進行了類似的測量。對于這些實驗中的每***個，我們隨后計算了 Δr、|(r × Δr)y|、|ΔS| 和 |Δθz|，作為所有重復生物膜中所有細胞軌跡的平均值。這些實驗表明，對于生物膜的變形（圖 3A）、恢復（圖 3B）和可塑性（圖 3C），較大的剪切速率和較大的生物膜體積通常會導致更高的細胞位移參數（Δr、|(r × Δr)y|），但 Δr 可塑性除外，其并不強烈依賴于生物膜體積。有趣的是，這些實驗還表明，細胞取向的***大變化（|ΔS|、|Δθz|）發生在小體積的生物膜和大剪切速率的情況下（圖 3）。小生物膜表現出強烈的細胞取向變化，因為其表面積與體積之比大，并且更大比例的細胞直接經歷流體剪切。然而，體積小的生物膜不會表現出大的細胞位移，因為它們的高度相對較低，細胞的 z 位置是細胞位移的關鍵決定因素（圖 1C - E 和 2C）。對于四個參數（Δr、|(r × Δr)y|、|ΔS|、|Δθz|）中的每***個，在變形（圖 3A）、恢復（圖 3B）和可塑性（圖 3C）中，生物膜體積與剪切速率熱圖的模式是相似的。無論生物膜體積如何，***大剪切速率的值是變形、恢復和可塑性過程中結構變化幅度的關鍵控制參數（圖 3）。

生物膜中彈性模量的空間分布
在變形和恢復過程中，生物膜結構的變化幅度相似但方向相反，這表明生物膜對剪切流的響應存在彈性成分（圖 1C - E 和 2C、D）。為了推斷生物膜內彈性模量的空間分布，我們將細胞位移的空間分辨測量結果與以彈性模量為參數的生物膜通用力學模型結合使用。對于此模型，在施加流動之前，我們根據實驗確定的每個細胞的細胞質心坐標創建了***個 3D 德勞內三角剖分，并假設三角剖分中由邊 e = (i, j) 連接的所有相鄰細胞質心 i 和 j 都通過***個未知剛度 ke 的彈簧連接，彈簧具有靜止長度 （圖 4A，見實驗部分）。在強剪切流期間，生物膜變形，我們使用實驗中的細胞追蹤數據來測量每個彈簧的***終長度 le。系統的彈性能為 ，對于生物膜內部坐標為 ri 的每個細胞 i，彈性力平衡，使得 ?H/? ri = 0。重要的是，彈性力僅在生物膜彈性內部的細胞之間平衡，而對于生物膜邊界部分的細胞不平衡，這些邊界細胞會受到流體剪切力或細胞與基底表面的粘附力。為了推斷生物膜內部的彈性特性，不需要為生物膜邊界上的細胞明確建模這些外力。然后，我們針對生物膜中彈性模量 的空間分布求解此模型，僅尋找連續變化的解（見實驗部分）。我們通過展示該框架能夠基于實驗確定的細胞質心位置準確恢復我們在模擬生物膜中指定的彈簧剛度（ke）和模量來證明其穩健性。

圖4，生物膜中物質特性的空間分布與細胞外基質成分的空間分布相關。A）用于推斷機械特性空間分布的模型示意圖：在該模型中，在德勞內三角剖分中為相鄰的細胞質心通過未知剛度 k 且靜止長度為 l0 的彈簧連接。然后，我們使用流動前和流動期間細胞位置的實驗測量值，以及生物膜內部細胞的力平衡條件，來推斷生物膜內部相對彈簧模量的空間分布，而沒有明確模擬生物膜邊界部分細胞的流體 - 細胞或細胞 - 基底表面相互作用（見實驗部分）。B）具有歸***化 xy 徑向位置和歸***化 z 位置的彈簧模量 kl0 的空間分布。數據是對 n = 10 個獨立的重復生物膜進行平均。熱圖底部的灰色區域表示直接附著在基底表面的細胞（0 ≤ z/Rz ≤ 0.0453）所占據的區域，對于該區域，我們的模型無法提供彈簧模量。C）使用免疫熒光和共聚焦顯微鏡測量的生物膜內基質蛋白 RbmC 的空間分布。RbmC 的其他數據見圖 S11A（支持信息）。數據使用與（B）中相同的坐標系繪制。D）使用免疫熒光測量的基質蛋白 Bap1 的空間分布。Bap1 的其他數據見圖 S11B（支持信息）。E）使用免疫熒光測量的基質蛋白 RbmA 的空間分布。RbmA 的其他數據見圖 S11C（支持信息）。F）使用熒光共軛凝集素測量的基質多糖 VPS 的空間分布。正如在圖 S12（支持信息）中 VPS 標記的原始圖像所示，即使在沒有細胞附著的區域，凝集素也優先附著在玻璃表面。來自玻璃表面的這種信號泄漏到生物膜的較高區域，因此我們無法準確確定灰色區域中的 VPS 豐度。每個基質成分的數據是對≥ 3 個獨立的重復生物膜進行平均。每個基質成分的顏色標度是背景扣除后的熒光強度。

細胞外基質成分的空間分布解釋了彈性模量
我們假設彈簧模量的空間模式是由自產細胞外生物膜基質成分的變化引起的。為了驗證這***點，我們測量了霍亂弧菌生物膜主要基質成分的定位和豐度：蛋白質 RbmA、RbmC、Bap1 和弧菌多糖（VPS）。為了使用共聚焦顯微鏡直接對基質成分進行成像，我們使用了與熒光染料偶聯的針對 RbmA、RbmC 和 Bap1 的抗體，以及與熒光染料偶聯的針對 VPS 的凝集素。

這些實驗表明，對于我們微流體系統中的生物膜，RbmC 在生物膜底部邊緣附近含量豐富（圖 4C），Bap1 位于生物膜底部表面和暴露于流體的外邊緣附近（圖 4D），RbmA 在生物膜面向流體表面的區域高度豐富（圖 4E）。缺乏 RbmC 或 Bap1 的突變體形成的生物膜對高剪切速率具有顯著的抗性。沒有 RbmA 的生物膜在高剪切速率下很容易從表面剝落，這表明該蛋白質對于生物膜的機械凝聚力很重要，可能是由于其交聯了長鏈多糖 VPS。然而，基質蛋白 RbmC、Bap1 和 RbmA 的空間分布與彈性模量的空間分布沒有定性的相關性。相比之下，細胞外基質多糖 VPS 顯示出與彈性模量密切相關的空間分布（圖 4F），這表明 VPS 的豐度是決定生物膜彈性細胞 - 細胞相互作用和對剪切流的整體彈性響應的關鍵因素。

通過使 3D 霍亂弧菌生物膜經受剪切流的增加和減少，并追蹤由此產生的單個細胞位移和細胞重新定向，我們能夠進行空間分辨的體內流變學測量。盡管存在強剪切速率（= 8.16 × 104 s?1）和剪切應力（τ = 69.7 N / m?2），對應于微流體通道中的平均流速 Uaverage = 0.952 m / s?1，但生物膜對剪切流的增加仍然具有顯著的彈性。生物膜內的細胞位移軌跡顯示出彈性響應，以及約為彈性響應 1/3 大小的塑性響應。細胞定向也顯示出與彈性響應大小相似的塑性響應。此外，生物膜內的彈性和塑性響應在空間上是異質的。

3D 生物膜內彈性響應的空間變化使我們推測這些群落內部的彈性模量也在空間上發生變化。通過假設基于連接相鄰細胞的彈簧網絡的生物膜通用力學模型，我們使用我們的細胞位移軌跡來獲得生物膜中細胞 - 細胞相互作用的彈簧模量的空間分辨圖。彈簧模量的空間分布與連接生物膜局部分子組成與微觀細胞軌跡和細胞群落的介觀材料特性的基質多糖 VPS 的豐度密切相關。我們在細胞尺度上對空間變化的材料特性的觀察補充了以前沒有空間分辨率的生物膜流變學的宏觀表征。

我們基于結合實驗細胞追蹤數據和通用彈簧網絡模型開發的用于推斷細菌生物膜體內內部彈性特性的方法，可用于推斷任何可以進行細胞分辨率成像的不均勻彈性生物材料的內部特性。由于 3D 活細胞顯微鏡技術的***新改進和基于神經網絡的圖像分析能夠為許多其他生物系統獲得單細胞水平的數據，我們預計我們的推斷框架將廣泛適用于細胞尺度上生物材料的體內流變學分析。

在生長過程中，生物組織和微生物群落消耗營養物質并產生廢物，這建立了資源梯度和局部變化的微環境，***終導致局部變化的基因表達和局部變化的基質成分產生。由于這些資源梯度預計不會隨時間保持恒定，我們預計生物膜的材料特性不僅如本研究所示在空間上是異質的，而且在時間上也是異質的。生物膜的時空材料特性的全譜尚未得到表征，這可能為通過機械剪切去除生物膜以及設計具有可調剪切響應的生物材料揭示機會窗口。

Video 2: 使用 0.1 微米的熒光示蹤珠，對微流控通道中霍亂弧菌生物膜菌落周圍的流動情況進行了可視化展示。視頻中的不同畫面幀對應著通道中不同的 z 高度（z 位置在左上角標明）。對于通道中的每個特定 z 位置，視頻的每個畫面幀都展示了示蹤珠的原始熒光圖像（左）、帶有疊加流場矢量的生物膜原始熒光圖像（中）以及生物膜周圍的流速（右）。

細菌培養與生物膜生長

本研究中使用的主要菌株源自霍亂弧菌 N16961 野生型，通過引入賦予粗糙度的 vpvCW240R 等位基因，并引入導致直桿狀細胞形狀的?crvA（VCA1075）突變。該菌株還含有***個質粒（pNUT542），該質粒帶有慶大霉素抗性和***個無 lacO 的 Ptac 啟動子，以驅動 sfGFP 的組成型產生。所得的細菌菌株稱為 KDV613，[52]并用于本研究中的所有剪切流變形實驗。本研究中使用的其他菌株均為 KDV613 的衍生物，但 KDV2013 除外，它含有不同的質粒。霍亂弧菌生物膜在 M9 基本培養基中生長，該培養基補充有 2 mM MgSO4、100 μm CaCl2、MEM 維生素（Sigma）、0.5% w/v 葡萄糖和 15 mM 三乙醇胺（pH 7.1）。LB 培養基用于過夜培養，包含 10 g L?1 胰蛋白胨、5 g L?1 酵母提取物和 10 g L?1 NaCl。此外，向 LB 和 M9 培養基中加入 30 μg mL?1 慶大霉素，以維持質粒 pNUT542。

產生 sfGFP 的霍亂弧菌生物膜在微流控流動室（室尺寸：[寬度；高度；長度] = [500；70；7000] μm）中生長。流動室由通過氧等離子體與玻璃蓋玻片結合的聚二甲基硅氧烷構建而成。微流控設計在每個蓋玻片上包括四個獨立的通道。這些微流控通道的制造過程保證了高度可重復的通道尺寸和表面特性。每個通道都接種了霍亂弧菌菌株的培養物，培養物的制備如下：在液體 LB 培養基中于 28°C 振蕩條件下過夜培養，早晨在 LB 培養基中以 1:200 回稀釋，并培養至 600 nm 處的光密度為 0.5。該培養物用于接種流動通道。通道接種后，1 小時內不啟動流動，以允許細胞牢固地附著在表面。然后，以 100 μL / min?1 的流速將液體 M9 培養基通過通道推送 45 秒，以洗去非粘附細胞并從通道中去除 LB 生長培養基。然后將通過通道的流速設置為 0.5 μL / min?1，以連續向通道供應新鮮的 M9 培養基，使表面粘附的單細胞生長為生物膜。通道接種后的流速和生物膜生長期間的流速使用高精度注射泵控制。

不同流體剪切力的實驗
霍亂弧菌生物膜在微流體流動室中培養，存在低流速（0.5 μL min?1，20.4 s?1），該流速由注射泵控制。在生物膜高度 Rz 達到約 10 - 30 μm 后，將注射泵與流動室的入口斷開，并由微流體壓力控制器（OB1 MK3+，Elveflow）取代。該壓力控制器通過整合來自流量傳感器（MFS5，Elveflow）的反饋，能夠向微通道施加更高且更穩定的流速。流速、顯微鏡載物臺和 3D 共聚焦成像通過使用 MATLAB 控制 μManager[63]和流量控制軟件（ESI，Elveflow）同時進行控制。為了在強流實驗期間抑制蛋白質產生和細胞分裂，在 M9 培養基中加入兩種抗生素（10 μg mL?1 甲氧芐啶，3 μg mL?1 四環素），并在開始成像和改變流速之前讓其在通道中流動 10 分鐘。強流以階躍函數的形式施加：從 0 μL min?1 開始，然后變為目標強流速，然后再次設置為 0 μL min?1。由于壓力控制器對流速加速的限制，從 0 增加到 2000 μL min?1 并使微流體通道中的流速穩定下來需要 15 秒，這是該系統中可達到的***大幅度。同樣，將流速從 2000 μL min?1 降低并穩定回 0 μL min?1 也需要 15 秒。在 3 個時間點對 3D 生物膜體積進行成像：施加強流之前、強流期間（流速增加 1 分鐘后）和流速降低 1 分鐘后（圖 1A）。作為實驗參數，生物膜暴露于不同的***大流速（100、200、500、1000、2000 μL min?1），或者使用不同體積 V 的生物膜（519 μm3 < V < 6032 μm3），或者改變高流速的持續時間（3、5、10、20、40 分鐘）。每個生物膜變形測量都是在不同的微流體通道中對之前未暴露的生物膜進行的。

(文章來源于儀器網)