通常，當我們提到光學切片時，***先想到的是共聚焦顯微鏡[1]。共聚焦原理已經無縫地集成到標準型光學顯微鏡中（盡管技術整合需要進行大量的修改）。與普通光學顯微鏡不同，真正的共聚焦成像要求照亮盡可能小的單點。光斑的直徑由波動光學決定，并在d≈λ/NA時達到衍射極限***小值。詳細的強度分布由點擴散函數描述。同時，探測器也必須感知盡可能小的光斑。由于光路是對稱的，同樣的數學原理也適用于點狀探測器的傳感分布。通過在檢測路徑中的中間像面引入針孔光圈來實現點探測器。在樣本中，照明和檢測的焦點必須重合——因此稱為“共聚焦”顯微鏡。如圖1所示，針孔的效果是光學地去除所有不是來自焦平面的光線。它的功能是在z方向上作為空間濾波器。

由于光學刀片***次僅在***個單點上工作，為了生成圖像，這個點必須從上到下逐行移動。強度同步轉換為數字信息，并存儲在計算機的幀存儲器中。從這種電子存儲器中，圖像在普通監視器上顯示。由于圖像必須逐點順序構建，因此只有在影響幀格式和接受的信噪比的***定限制下，才能實現高幀率。例如Leica SP探測器和混合探測器（HyDs）等高度透明的光束路徑以及非常高效的傳感器有助于提高高幀率性能。與PAL標準顯示的線頻率約為15,000 Hz相比，共聚焦顯微鏡實現了高達12,000 Hz的線頻率。在適當的條件下，每秒的幀率可能高達約500幀。盡管如此，為了獲得信噪比足夠高的圖像，幀率通常不會超過每秒10幀。

與掃描過程相關的另***個問題是，樣品中焦點平面以上和以下的區域會暴露于大量照明能量，這些能量不會貢獻于圖像，但可能會導致熒光染料的光物理降解。由于熒光染料在焦點平面以上也會吸收光，因此當深入樣品聚焦時，熒光強度會變得越來越暗。這可以通過自動增益適應來補償，但會降低信噪比。

真正共聚焦成像的積極方面在于其高分辨率（易于應用高數值孔徑鏡頭）、焦點平面上的圖像本身均勻，以及共聚焦顯微鏡可以輕松分析標準制備。共聚焦顯微鏡基于標準同軸光學顯微鏡，通過簡單的切換，顯微學***可以使用所有標準的顯微鏡方法和對比度模式。它也是其他類型掃描顯微鏡的基礎，如多光子激發、高次諧波產生顯微術、相干反斯托克斯拉曼散射顯微術和超分辨率技術STED（受激發射損耗顯微術）。

盡管共聚焦顯微鏡是光學切片技術的黃金標準，但執行這***任務的第***臺顯微鏡早在半個世紀前就已經問世。這款“Spalt-Ultramikroskop”[2]使用了***個明亮的光源（弧光燈或太陽），該光源聚焦到***個狹縫孔徑中。第二個透鏡，通常是***個再利用的物鏡，將這個狹縫正交投影到顯微鏡的光軸上的樣本中。這種設計有效地創建了***個厚度約為兩微米的片狀光。早期的應用是關注亞分辨率粒子，如彩色玻璃中的分散金。后來證明它對化學和醫學研究中常見的各種膠體樣品和混濁介質非常有用。這種早期的光片顯微鏡***于可視化小到5納米的粒子，這些粒子會引起照明的球形散射，這種散射在顯微鏡的垂直光束路徑中作為衍射圖案被觀察到。因此，它可視化的是稱為“Ultramikronen”的不可解析粒子，即“超出顯微鏡分辨率”的粒子。盡管“超顯微鏡”這個名字***先會讓人聯想到***種超分辨率類型的設計，但作者明確表示，超顯微鏡明顯受到光學衍射的限制。

后來，人們開發了避開精密狹縫的設計，并使用了筒鏡來創建垂直于光軸的片狀光[3]。這種布置隨后被用于熒光固定樣本。光片顯微鏡特別有利于對厚樣本進行快速活細胞成像，因為漂白現象不太明顯，而且圖像記錄是由數字相機并行進行的，如Huisken所示[6]。由于照明在z方向上聚焦的所有位置都是相等的，因此z方向上的吸收不是問題。然而，發射光必須通過樣本，就像普通顯微鏡***樣，這可能會在***定程度上使厚樣本的圖像質量變差。盡管如此，在側向方向上仍然存在陰影效應：光***先被照明光進入樣本的***側吸收，因此，熒光在相反的***側會變暗。Voie[3]通過旋轉樣本并從不同方向收集圖像來補償這種效應。Dodt[7]從兩個相對的方向照射樣本，以補償光片的光吸收。Keller[4]沒有使用投射的狹縫孔徑或圓柱形透鏡，而是掃描了垂直于觀察軸的細激光束。這種方案被稱為“數字掃描光片”。

這兩種范例都已被引入生物醫學研究和常規流程中，為生物概念和疾病以及細胞成分的構造和功能提供了新的見解和理解。在儀器方面，這兩種方法存在顯著差異，正交照明被視為系統的獨立部分，并與同軸顯微鏡結合以執行任務。共聚焦顯微鏡使用光束掃描系統創建二維圖像，而數字掃描光片使用光束掃描從線條創建區域。這立即引發了***個問題，即是否有可能將這兩種策略結合到單個系統中。（Leica Microsystems）使用STELLARIS DLS光片顯微鏡[5]提供了這種解決方案。

STELLARIS DLS基于普通共聚焦顯微鏡，這是***種同軸掃描設備，它通過檢測針孔在空間上過濾失焦光來進行光學切片。通過電流計掃描鏡使照明光斑在兩個側向方向上移動來生成圖像。要將這樣的系統轉換為數字光片顯微鏡，必須使照明光束通過樣本，垂直于光軸。通過在觀察場外的焦平面位置引入***個小鏡子，可以實現所需的正交照明。這種偏轉鏡與觀察鏡機械連接，以確保照明的z位置始終位于圖像生成光學的焦點上，同時圖像被投射到檢測器上，將強度轉換為數字圖像。

照明光束的單個位置不會形成二維圖像，而只會形成***條線。可以利用共聚焦顯微鏡中固有的***個側向掃描模式來在垂直方向上掃描照明線，從而得到所需的二維平面。

如果在相反的***側引入第二個鏡子，就可以通過同***透鏡從兩側照射樣本——僅通過使用共聚焦顯微鏡的光束掃描設備的第二個軸。這滿足了補償因吸收導致的陰影的需要。之后的圖像隨后再由兩個不同照明方向的圖像重新構建。

在共聚焦模式下進行成像時，必須調整z軸驅動元件，使照明光束的焦點與要成像的特征重合。然后，掃描過程僅覆蓋視場內部，有效抑制了焦外光，從而獲得高對比度的圖像。切換到光片采集模式時，需要將焦點移動約等于鏡面到光軸的距離。此時，光束的平面生成部分將落在觀察視場的中心。掃描裝置需要指向視場邊緣，才能照射到鏡面并生成光片。

這種組合不僅降低了儀器成本，因為兩個不同的儀器合并為***個，而且它還允許將經典共聚焦顯微鏡和光片顯微鏡結合起來。因此，同***系統允許使用適合解決當前研究問題的技術來探索任何樣本。它還為各種新的應用機會提供了可能，因為共聚焦路徑可用于光操控，隨后通過溫和的光片成像觀察誘導效應。