肺癌是當異常細胞在肺部以不受控制的方式生長時開始的***種癌癥。它是***個嚴重的健康問題，可以導致嚴重的傷害和死亡,是全世界癌癥相關死亡的主要原因，在男性和女性中的死亡率均為***高。目前，靶向治療是***種以干擾癌變或腫瘤增生所需的特定分子來阻止癌細胞增長的***種藥物療法，對于腫瘤中發現特定基因突變或生物標志物的患者來說，是***種重要的選擇。

***近，北京大學基礎醫學院林志強團隊在***際知名期刊Chemical Engineering Journal（IF=15.1）發表***篇題為“An elastase nanocomplex with metal cofactors for enhancement of target protein cleavage activity and synergistic antitumor effect”的文章。該研究借鑒金屬離子調節蛋白質功能和活性的方式，采用基于金屬輔因子的方法，以胰腺彈性蛋白酶(PPE，ELANE 同系物)為模型藥物，增強靶蛋白裂解和抗腫瘤效應。作者體外開發并優 化了***種具有增強裂解活性的彈性蛋白酶納米復合物(CAEN)，借助玉研肺部霧化給藥裝置定量靶向給予到小鼠肺部，CAEN阻止了PPE在生物環境中的降解，并有效地將其傳遞給腫瘤細胞。通過有效裂解跨膜蛋白CD95(與游離PPE相比具有更高的特異性)，CAEN在肺癌細胞中誘導了顯著的凋亡。

CAEN主要通過無創霧化吸入進入肺組織，實現肺組織特異性蛋白藥物傳遞(圖1)。在腫瘤細胞中，從CAEN釋放的PPE與Mn2+嵌合體特異性裂解腫瘤細胞的跨膜蛋白CD95，導致細胞凋亡，而且釋放的Mn2+能有效增強肺部腫瘤組織的局部免疫反應。

圖1 彈性蛋白酶納米復合物(CAEN)

由于血液中存在多種絲氨酸蛋白酶，因此在實際應用中可能會抑制PPE的活性。作者為了驗證CAEN對血清的敏感性，在不同細胞系中使用了含或不含胎牛血清的培養基進行細胞毒性試驗。結果如圖2所示。CAEN組在使用含或不含血清培養基進行實驗時，均表現出顯著的細胞毒性作用。

圖2 不同制劑（含或不含血清）處理后的細胞存活率

上述實驗表明設計的CAEN能夠穩定PPE的活性，防止其受到血清中蛋白酶抑制劑的抑制，達到完全的抗腫瘤效果。這充分說明金屬離子的礦化改性策略有望提供***種保護PPE活性的方法，CAEN的生物礦化作用為這類功能蛋白在抗腫瘤治療中的有效活性提供了納米屏障。

為了驗證不同制劑組裂解CD95的能力，作者純化了MBP-CD95蛋白并進行切割實驗。***先，將不同制備組與MBP-CD95蛋白孵育30min，結果見圖3兩組之間的差異在于PPE組完全裂解WBP-CD95，而CAEN組僅選擇性裂解CD95蛋白。因此，彈性蛋白酶與錳離子的生物礦化復合物可以實現CD95 蛋白的特異性裂解。

圖3 不同制劑與MBP-CD95體外切割效果驗證

作者在B16-F10腫瘤細胞上進行了細胞凋亡實驗。流式細胞術結果顯示，CAEN治療組發生凋亡的腫瘤細胞比例***顯著，表明CAEN具有誘導細胞凋亡的能力。

圖4 不同制劑凋亡實驗細胞儀數據分析

上述實驗強調了CAEN裂解靶蛋白的潛力及其抗腫瘤作用。

研究表明，與靜脈給藥相比，吸入和遞送治療藥劑可對局部惡性腫瘤組織實現更好的治療效果，并降低不相關的全身效應的可能性。在文章中，作者使用玉研儀器公司的肺部霧化給藥裝置（YAN-30012）對小鼠肺部定量輸送CAEN制劑。

為了驗證霧化裝置能夠成功給藥，作者使用考馬斯亮藍溶液(CBB)作為指示劑來證明藥物可以有效地進入小鼠的肺組織。圖5可以觀察到小鼠肺組織中有明顯量的CBB液，主要均勻分布在氣管、支氣管。因此，肺部霧化給藥有望有效實現納米粒子的局部遞送和組織器官的特異性治療。

圖5 考馬斯亮藍溶液已被霧化吸入

為了檢驗CAEN在肺部的滯留，作者使用Cy7熒光染料標記的PPE和CAEN進行肺部霧化給藥，并取出肺組織用于熒光成像觀察。實驗結果表明，采用肺部霧化給藥方法可使CAEN均勻進入肺組織。

圖6 不同制劑（含或不含血清）處理后的細胞存活率

此外，作者還評估了肺部霧化給藥后不同制劑在肺組織中的跨粘膜吸收行為。吸入PPE-Cy7和CAEN-Cy7后24小時，處死小鼠，采集肺進行熒光成像。熒光成像如圖所示，在用CAEN-Cy7處理的肺中觀察到更強和更深的熒光分布，表明礦化納米顆粒作為載體表現出優異的滲透和保留能力，能夠顯著改善生物大分子蛋白的跨粘膜通透性和截留率。

圖7 各組離體器官和肺組織切片熒光成像結果

上述實驗結果表明，與游離蛋白相比，CAEN能提高細胞攝取效率，并延長蛋白在局部組織中的保留時問。

為驗證CAEN的抗腫瘤作用，C57BL/6小鼠經尾靜脈注射B16-F10細胞，形成肺癌模型。在第5、9、13、17天使用玉研肺部霧化給藥裝置給小鼠肺部給藥，進行局部抗腫瘤治療。在第5、13和21天，解剖小鼠并收集其肺組織。隨后，作者計數了小鼠肺組織中的轉移灶（圖8）。CAEN組在抗腫瘤治療期間保持了優異的治療效果，無明顯轉移。PPE組出現了明顯的轉移灶，這可能是由于PPE氣霧劑吸入無法有效進入腫瘤細胞，使肺組織表面的彈性纖維降解，促進了腫瘤細胞的轉移。

腫瘤組織H&E染色顯示（圖9），CAEN給藥組小鼠組織切片中癌細胞較少，而PBS組和PPE組中癌細胞較多。

圖8 小鼠肺部給藥示意圖

圖9 使用PBS、PPE和CAEN治療的小鼠肺組織圖像和肺轉移結節數量

圖10 肺組織轉移灶的H&E染色組織學檢查

健康小鼠經同樣處理后（圖11），發現 PPE處理組對健康小鼠肺組織造成炎性損傷，CAEN處理組和PBS處理組無明顯變化。PPE蛋白對肺組織的損傷有利于腫瘤的擴散和轉移，這也解釋了PPE治療組小鼠在第21天出現嚴重腫瘤病變的原因。

圖11 未接種腫瘤的小鼠經同樣處理后肺組織的H&E染色結果

TUNEL染色（圖12）證實CAEN有效誘導細胞凋亡，其中CAEN組CD8+T細胞比例***高，提示其在肺腫瘤組織中有高度浸潤，有利于殺傷腫瘤細胞。

圖12 各組小鼠肺組織TUNEL和CD8+T細胞染色結果

CAEN可以通過肺部霧化給藥實現器官特異性遞送，擴大了PPE蛋白的應用范圍。在動物實驗中，CAEN在錳離子的輔助下，可顯著誘導腫瘤細胞凋亡，激活腫瘤組織的局部免疫反應。

豬胰腺彈性蛋白酶(PPE)作為***種新型的抗腫瘤蛋白藥物，具有很強的誘導腫瘤細胞凋亡的能力。然而，由于其固有的缺陷，PPE在腫瘤治療中的應用受到限制，在本研究中，作者設計并制備了***種切割活性增強的彈性蛋白酶納米復合體(CAEN)，該復合體含有Ca2+、PPE及其輔因子(Mn2+)以實現CD95 蛋白的特異性切割。CAEN不僅有效地保護和穩定了PPE蛋白的活性，而且在不同類型的癌細胞中也表現出有效的殺傷作用。通過玉研肺部霧化給藥裝置，有效實現了納米粒子CAEN在小鼠肺部的定量***靶向遞送和肺部組織器官的特異性治療效果。CAEN中金屬離子的釋放影響了肺部腫瘤細胞的內環境，導致腫瘤細胞內活性氧水平升高和線粒體損傷。結合Mn2+的免疫激活功能，CAEN在體內外均能有效抑制腫瘤細胞的生長，具有良好的生物安全性?？傊?，該研究為蛋白質藥物在抗腫瘤治療中的應用提供了有效的研究思路。

通堵裝置是***種玉研儀器***新設計，用于清除肺部給藥裝置針頭管道內的堵塞物，和保證肺部給藥裝置內管道暢通的工具。