圖1 通過 Echo進行PCR體系構(gòu)建。

Gibson DNA連接方法是合成生物學中使用***多的技術(shù)，它可以組裝從DNA序列至小基因組重疊DNA片段大小，優(yōu)點是它與序列無關(guān)并生成無痕DNA連接產(chǎn)物。Golden Gate DNA連接方法利用TypeIIS限制性內(nèi)切酶和連接酶組合來組裝DNA片段。正如我們先前所介紹的***樣，使用Echo聲波移液，能夠?qū)崿F(xiàn)這兩種***步式DNA連接反應(yīng)的降本增效，可在250 nL、500nL和1000 nL反應(yīng)體積下實現(xiàn)Gibson的正確組裝，效率可與手工實驗相媲美或優(yōu)于20 μL反應(yīng)，這使試劑成本降低20倍以上；Golden Gate可實現(xiàn)50 nL 、250 nL和500 nL規(guī)模反應(yīng)體積的DNA（手工實驗時通常為 15 μL反應(yīng)）成功組裝，效率同樣高于手工實驗對照，使試劑用量至少降低30倍。

生物合成途徑的闡明和重構(gòu)以及調(diào)控回路和網(wǎng)絡(luò)的工程設(shè)計，都需要蛋白質(zhì)功能的知識。植物***直被用作生物活性和高價值天然產(chǎn)物的來源，但由于植物之中大型基因***族的普遍存在，使得將特定功能與單個蛋白質(zhì)聯(lián)系起來具有挑戰(zhàn)性，同時也面臨需要付出大量努力來優(yōu)化表達和純化方案進行蛋白質(zhì)表征這***技術(shù)瓶頸。Biofoundry的獨特優(yōu)勢能夠加速“設(shè)計-構(gòu)建-測試-學習”周期的能力，可加速優(yōu)化并實現(xiàn)酶活性的快速篩選；無細胞蛋白質(zhì)合成（CFPS）結(jié)合了DNA模板、能量源、氨基酸、核苷酸三磷酸 （NTP） 和過量輔因子，以及含有翻譯機制的粗裂解物，是***種成熟的體外快速蛋白質(zhì)生產(chǎn)工具，顯著優(yōu)勢是能夠直接進行功能分析，而無需耗時的細胞破碎和純化方案，同時還適用于自動化和小型化，減少操作錯誤和CFPS反應(yīng)中的可變性，促進主動學習引導(dǎo)的反應(yīng)條件優(yōu)化，并普遍增加實驗的通量，***大限度地減少DBTL循環(huán)中的“構(gòu)建”時間。SynTrack是***個基于web的工作流程驅(qū)動的bioCAM平臺，用于管理和跟蹤DNA制造過程。SynTrack導(dǎo)入boost指定的構(gòu)建過程信息，其中包括操作人員（利用機器人平臺）執(zhí)行所有“構(gòu)建”操作的分步說明。SynTrack可以為液體處理機器人（如Biomek FX和Echo平臺）生成移液指令，自動將接收到的DNA片段重新排列到孔板中。通過Echo自動化平臺構(gòu)建2μL反應(yīng)體積（手動為20μL）進行***步法Golden Gate DNA組裝反應(yīng)，隨后構(gòu)建2μL CFPS反應(yīng)體系進行蛋白表達，通過熒光素酶（該標簽可輕松去除）快速定量蛋白表達水平，隨后無需蛋白純化即可使用游離蛋白質(zhì)合成反應(yīng)產(chǎn)物進行多種功能表征。

圖2 Biofoundry輔助DNA組裝和植物蛋白游離蛋白合成（CFPS）的工作流程。編碼目的蛋白的0***DNA部分（模塊）可以組裝成用于CFPS或在植物中表達的功能表達質(zhì)粒。使用Echo篩選蛋白質(zhì)變體的文庫，使用 HiBiTLgBiT熒光素酶發(fā)光實驗定量確定***佳表達構(gòu)型。

使用Echo聲波移液配合無細胞蛋白合成（CFPS）技術(shù)也可在96和384孔板中進行代謝工程檢測，通過Wood-Ljungdahl通路耦合的反向β氧化（r-BOX）通路，實現(xiàn)如C4-C6酸和醇生化產(chǎn)物的負碳合成，具有降低全球CO2排放的巨大應(yīng)用潛能。正是由于模式生物大腸桿菌無細胞轉(zhuǎn)錄-翻譯（TXTL）在DNA定向體外蛋白質(zhì)合成的應(yīng)用范圍越來越大，***些實驗室也開發(fā)了全大腸桿菌TXTL工具箱，并通過Echo實現(xiàn)了流程自動化。另***個無細胞合成生物應(yīng)用方向是非模式生物體外原型設(shè)計和快速表征代謝途徑，加速體內(nèi)生物合成途徑測試，使例如梭狀芽胞桿菌等非模式生物能夠利用可再生資源（木質(zhì)纖維素生物質(zhì)或CO和H₂合成氣）生產(chǎn)更多高價值產(chǎn)品。使用DNA組裝設(shè)計自動化軟件J5進行結(jié)構(gòu)設(shè)計和生成實驗運行worklist，發(fā)送至Echo自動化平臺以2 μL體積進行Golden Gate DNA組裝，可同時進行多達6個部分（三個獨特啟動子和終止子序列的開放閱讀框）的組裝，效率高達90%；這***質(zhì)粒系統(tǒng)將為非模式生物提供體外和體內(nèi)生物合成途徑的簡單測試框架，從而縮短開發(fā)周期。非模式生物巨雙歧桿菌的天然無細胞（NCF）轉(zhuǎn)錄翻譯平臺的快速建立也借助了Echo，并和貝葉斯模型參數(shù)推斷方法相結(jié)合，可以在數(shù)小時內(nèi)對基因表達工具進行嚴格的表征，并且這個平臺還有望擴展到***系列其他重要的底盤微生物的合成生物學應(yīng)用。

圖3 使用兼容的無細胞載體系統(tǒng)組裝三基因構(gòu)建體的Golden Gate。（a）Golden Gate組裝工作流程的示意圖，包括自動化組裝，包括質(zhì)粒的計算設(shè)計、Echo自動化液體處理操作指令、質(zhì)粒組裝和質(zhì)粒確認。（b）含有構(gòu)建的梭狀芽孢桿菌表達載體的六個克隆中的質(zhì)粒組裝的PCR鑒定。

圖4 非模型微生物的無細胞原型設(shè)計。（A）在NCF中使用內(nèi)源性能量再生和轉(zhuǎn)錄-翻譯組分測試合成的基因表達質(zhì)粒。（B）在B. megaterium NCF中使用MGapt（mRNA）適配體和GFP進行平行轉(zhuǎn)錄-翻譯測定。（C）借助Echo液體處理工作站，用于快速篩選無細胞反應(yīng)的半自動化工作流程。

微生物系統(tǒng)中異源生產(chǎn)的特定高價值化學物質(zhì)大多需要資源密集型分析過程（如HPLC和MS）進行定量，較低的分析通量使DBTL循環(huán)遇到了***定的瓶頸。而生物傳感器通常與基因表達系統(tǒng)耦合，為此人們越來越關(guān)注開發(fā)熒光生物傳感器用于合成生物學中，來檢測小分子和物理信號。通過為Echo編寫Python移液腳本，構(gòu)建384或1536孔板的10μL或2μL熒光酶標檢測體系，基于大腸桿菌雙鍵還原酶（EcCurA）非特異性結(jié)合后熒光極大增強的特性，開發(fā)了***種熒光復(fù)合物直接蛋白質(zhì)（DiPro）生物傳感器，作為微生物異源姜黃素酶促合成的檢測單元，且不需要任何額外的基因表達后步驟或特定的蛋白質(zhì)成熟要求。同樣，使用Echo進行小反應(yīng)體系的熒光素酶化學發(fā)光體系構(gòu)建，高通量篩選分析脯氨酰寡肽酶異源表達變異株，將金屬響應(yīng)開關(guān)整合到蛋白質(zhì)中，也為精確調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能提供了新的機會。

圖5 Ni(II)依賴的開關(guān)