空間代謝組學：單細胞空間代謝流分析新方法
生物體內的代謝物和脂質不僅是細胞的關鍵組成模塊，它們在信號傳導、表觀基因組調控、免疫、炎癥和癌癥發展中同樣具有重要作用和意義。代謝組學分析是我們了解、評估生物體、器官和細胞狀態的重要方式。而單細胞技術通過展示組織內部甚至單克隆細胞之間的細胞異質性，將生物學研究推進至新維度。質譜成像（MSI）技術可以從樣品中創建特定化合物的圖像，這些圖像是由樣品表面獲得的數千個質譜生成的。每個記錄的質譜都會為圖像貢獻***個像素，而每個質譜中的峰都可以生成***個圖像。與其他成像方法相比，MSI無需化合物標記，可實現非靶向分析。
本次與大***分享的是***篇***新發表于bioRxiv上的有關單細胞空間代謝流分析方法的文章[1]。 研究人員基于AP-SMALDI Orbitrap平臺開發了***種命名為“13C-SpaceM”的新方法，通過13C標記的葡萄糖示蹤葡萄糖依賴性脂肪酸從頭合成途徑（glucose-dependent de novo lipogenesis）。本方法應用超高分辨率的基質輔助激光解吸/電離實現了單細胞質譜成像，并通過全離子碎裂模式（AIF）模擬了脂肪酸分析前處理過程中的皂化反應，對包括甘油磷脂在內的主要脂質中的脂肪酸部分實現了共同分析。超高靈敏度、高分辨質譜檢測器為單細胞內脂肪酸同位素檢測提供了準確的定性、定量結果。
研究人員通過鼠肝癌細胞的常氧-低氧模型，對檢測方法進行了驗證，確認方法的有效性。之后應用本方法分別檢測了ATP檸檬酸裂解酶基因敲降（ACLY knockdown）鼠肝癌細胞以及攜帶異檸檬酸脫氫酶（IDH）突變的小鼠膠質瘤腦組織切片，通過比較脂肪酸的同位素豐度變化評估脂肪酸從頭合成比例以及外源性脂肪酸攝取的變化。分析結果揭示了在脂肪酸從頭合成過程中，乙酰輔酶A池（Acetyl-CoA pool）中存在大量的空間異質性，這表明在微環境適應過程中發生了代謝重編程。 01 研究背景 大氣壓MALDI成像分析是通過AP-SMALDI5離子源配合Q Exactive plus高分辨質譜儀實現的。激光像素設置為 10×10 μm，激光衰減器角度設置為33°。質譜在負離子模式下采用******全掃描和全離子碎裂（AIF）掃描模式。AIF模式的隔離范圍為 m/z 600-1000，掃描范圍為m/z 100-400，分辨率 140k，***大注入時間500 ms，碰撞能量NC 25%。（圖1） 圖1. 單細胞代謝流質譜成像分析流程 （點擊查看大圖） MALDI分析前后，分別應用顯微鏡檢測，確定細胞影像位置及MALDI消融標記位置。通過檢測MALDI的消融標記，將其與細胞影像疊加，并通過應用數學公式進行解卷積，從而整合顯微鏡圖像和MALDI圖像。實現了應用MALDI成像質譜檢測到的單細胞分子輪廓。（圖2） 圖2. 整合顯微鏡和MALDI-MS分析結果實現單細胞質譜成像（點擊查看大圖） 03 鼠肝癌細胞常氧-低氧模型單細胞成像分析 研究人員使用了兩種表達不重疊的shRNA序列（ACLYkd oligo1和ACLYkd oligo 2）細胞系以及***個對照組細胞系。通過使用1 μg/mL的四環素處理細胞72小時實現了ACLY沉默。 質譜成像數據是以10 μm的像素大小獲得的，每個細胞的平均面積為550μm2，平均每個細胞有12個像素。通過應用二項式模型計算每個細胞的acetyl-CoA池標記程度p值，從而量化細胞質中acetyl-CoA池中從葡萄糖衍生的同位素標記acetyl-CoA的比例。測試結果與預期相符，ACLYkd細胞中的acetyl-CoA池標記水平低于對照組。值得注意的是，兩種ACLYkd細胞之間的差異非常明顯。ACLYkd oligo1的結果呈雙峰分布，p值的差異明顯較大，表明該細胞系存在兩個亞群體。其中***個模式顯示的p值與對照組相近，說明存在***個“沉默失敗”的細胞亞群。ACLYkd oligo1第二個模式具有的p值明顯則低于ACLYkd oligo 2，表明ACLYkd oligo 1中還存在***個“強沉默”的亞群，在這些細胞中，沉默效率非常高，導致acetyl-CoA同位素標記比例大幅降低。在ACLYkd oligo 2中，acetyl-CoA池的標記程度以及GFP報告基因強度顯示出更均***的分布。M+2峰是***能表現出ACLYkd oligo1細胞中“強沉默”群體的低acetyl-CoA標記表型的質譜峰。M+8峰則為對照組細胞的特征標記峰。M+2和M+8之間的差異可以作為顯示異質性的指標，用于展示葡萄糖對細胞質中acetyl-CoA的相對貢獻。因此，13C-SpaceM能夠檢測ACLY敲降細胞中的異質性，并識別不同的亞群體。這種單細胞和空間異質性無法通過整體分析揭示，顯示了13C-SpaceM方法的獨特優勢。 圖6. 細胞ACLY敲降后acetyl-CoA的同位素標記程度分析（點擊查看大圖） 05 腫瘤組學中氨基酸合成異質性的空間組學分析 研究人員分析了從橫向植入表達突變型異檸檬酸脫氫酶（IDH）和紅色熒光蛋白（RFP）的GL261膠質瘤細胞的小鼠大腦組織切片。在采集組織前的48小時，小鼠被喂食未標記的或含有U-13C葡萄糖的液體飲食。 ***先，研究人員分析了12C-葡萄糖飲食的腫瘤攜帶小鼠大腦切片中的酯化脂肪酸組成。通過比較質譜TIC與顯微鏡明場和熒光成像，發現整個大腦（包括腫瘤區域）的質譜離子響應很高（圖7a）。測試過程中，腫瘤區域與組織切片的其余部分分別采用10μm和50μm激光分辨率進行分析。對不同脂肪酸的空間分析揭示了在非腫瘤攜帶的腦半球組織中，脂肪酸豐度存在高度的異質性，我們可以僅根據它們的脂肪酸組成來識別的某些結構，如胼胝體和前連合部，這兩個區域都富含油酸（18:1）且棕櫚酸（16:0）、硬脂酸（18:0）和花生四烯酸（20:4）的含量低。有趣的是，盡管棕櫚酸、油酸、硬脂酸和花生四烯酸在腫瘤和周圍的大腦組織中的含量相似，肉豆蔻酸（14:0）和棕櫚酸（16:1）在腫瘤組織中則明顯增加。與大腦其它部分相比，腫瘤中必需脂肪酸亞麻油酸（18:2）和α/γ亞麻酸（18:3）也明顯增高。 之后，研究人員分析了喂食含有U-13C葡萄糖飲食的小鼠腫瘤組織，從腫瘤組織中選擇性分離出的5種主要從頭合成的脂肪酸的同位素分布（圖7c）。三種飽和脂肪酸肉豆蔻酸（14:0）、棕櫚酸（16:0）和硬脂酸（18:0）的13C攝入豐度較高，同位素分布***大分別可至M+10，M+12和M+14。其中，肉豆蔻酸M+0的強度極低，幾乎完全源自脂肪酸從頭合成。由于肉豆蔻酸對***些重要信號蛋白的翻譯后修飾很重要，這***發現表明膠質瘤可能選擇性地上調肉豆蔻酸的合成以促進自身生長。相比之下，兩種單不飽和脂肪酸，棕櫚酸（16:1）和油酸（18:1）的M+0同位素的相對豐度較高。硬脂酸和油酸的M+2同位素豐度明顯增加，表明它們是由未標記的前體（即棕櫚酸和棕櫚酸）延長形成的。研究人員進***步利用棕櫚酸的同位素分布計算acetyl-CoA池中源自葡萄糖的比例，發現腫瘤組織內的該比例同樣具有顯著的空間異質性（圖7d）。 圖7. 小鼠腦膠質瘤組織內部脂肪酸代謝空間異質性分析 總結
本文作者開發了***種全新的單細胞代謝流成像檢測方法，將超高激光分辨率的大氣壓MALDI與高分辨率、高靈敏度的質譜檢測器相結合，對細胞和腫瘤組織內的葡萄糖依賴性脂肪酸從頭合成途徑實現單細胞層面的空間分析。不僅為單細胞水平空間探測代謝活動提供了新的方法，還為正常和癌癥組織中的脂肪酸攝取、合成和修飾分析提供了前所未有的視角。
(文章來源于儀器網)
