由于微流控過程的可重復性、連續性和可擴展性，脂質藥物遞送系統的微流控制備越來越受歡迎。盡管該領域取得了令人興奮的發展，但由于缺乏制備臨床相關的空間穩定脂質體，微流控的多功能性和優越性仍需要進***步的證據。本研究描述了使用交錯人字形混合器芯片(SHM)優化不同剛度的PEG脂質體配方。研究和討論了過程參數(總流量(TFR)和水與乙醇流量比(FRR))和配方參數(脂質組分和組成、初始脂質濃度和水介質)的影響。脂質體配方包括1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(DOPC)、1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(DPPC)或1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(DSPC)，成功制備了含有膽固醇和PEG化脂質(DSPE-PEG2000)的脂質體配方，具有理想的尺寸(～100 nm)和分散性(<0.2)。通過pH梯度遠程負載法，成功將阿霉素以高(>80%)的封裝效率封裝在這些脂質體中，說明了其作為藥物遞送系統的雙層完整性和能力。我們證明了臨床相關的聚乙二醇化脂質體配方可以制備出與傳統技術相當的性能。我們還討論了聚乙二醇化脂質體微流控生產的局限性和建議。

脂質體是封閉的磷脂囊泡，已被臨床批準用于封裝各種治療和診斷。微流控技術已經被探索用于以良好控制、可重復和高通量的方式制備脂質體，從而克服了傳統技術的障礙，即批次間重復性低和通量有限。***近***個令人興奮的進展是交錯人字形微混合器(SHM)的發展，與傳統的微流體水動力聚焦(MHF)器件相比，它表現出良好的優越性(更高的通量，更快的混合和更小的稀釋)。

目前，有兩個障礙阻礙了微流控技術作為傳統技術的優選技術的發展：沒有先前微流控知識和經驗的研究人員在設計、選擇和操作微流控設備方面的障礙；以及對微流控技術是否能夠滿足其特定需求的擔憂，因為傳統方法已經能夠提供。前者已經通過微流控設備的商業化而得到緩解，而后者可以通過證明微流控技術在制備臨床相關的脂質體配方方面與傳統方法相比的功能性來解決。

迄今為止，大多數臨床批準(和臨床試驗)的脂質體配方是空間穩定的，直徑為100-150 nm。與非PEG化脂質體相比，PEG化脂質體顯示出更高的穩定性、更低的分散性和更長的血液循環時間。PEG化在臨床上的重要性已經通過將PEG脂質體納入臨床批準的脂質體配方：Doxil?和Onivyde?得到證明。盡管對空間穩定的藥物遞送系統有很高的需求，但大多數現有的微流體研究(不限于SHM)報告了非PEG化配方的生產。很少有研究報告了PEG化脂質體的制備，這些脂質體要么尺寸很小(約50 nm)，要么不穩定，要么分散性高(>0.2)。例如，Zhigaltsev等人未能使用SHM微流體生產穩定、均勻、高相變脂質體(DPPC或HSPC)，并需要與不飽和脂質混合以增強這些PEG化脂質體的穩定性。此外，這些報告中的大多數只研究了總流速(TFR)和水乙醇流速比(FRR)對脂質體質量的影響，因為它們是脂質體合成的***個工藝參數。這種方法可能已經證明了微流控技術的魯棒性和簡單性，其中納米顆粒的優化可以通過簡單地控制TFR和FRR來實現。另***方面，這可能表明我們對這種技術制備脂質體的局限性缺乏知識。即，僅通過優化加工參數，無法制備出具有***佳尺寸和分散性的配方。

到目前為止，這里已經有少數研究報告單獨的配方參數的影響：選擇水和/或有機介質；脂質濃度；脂質組分和組成對納米顆粒的制備。然而，關于***些參數的影響有矛盾的結果，可能由于微流控設備和調查值范圍的差異，導致難以做出結論性的比較。令人鼓舞的是，Forbes等人***近的研究使用SHM研究了制備溫度、脂質濃度、脂質組分和組成對非PEG化脂質體的脂質體大小和分散性的影響。在這里，我們已經成功地證明了使用SHM制備的PEG化脂質體配方具有理想的尺寸(約100 nm)和分散性(<0.2)。我們系統地研究了配方參數(水介質、初始脂質濃度、脂質組分和組成)的影響，以及加工參數(TFR和FRR)。據我們所知，這是第***個使用SHM生產穩定、均勻(約100 nm)的PEG化脂質體的報告，包括液體和固體脂質體配方，其中后者更具臨床意義。

微流控制備脂質方法
采用交錯人字形微混合器（SHM）作為微流控裝置制備脂質體。脂質體溶解于乙醇中，制備適當濃度和摩爾比的脂質混合物。制備脂質體的水溶液包括去離子水(DW)、等滲生理鹽水(NS;0.9% w/v NaCl)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;10 mM磷酸鹽，0.8% w/v NaCl,pH 7.4)、HEPES緩沖鹽水(HBS;20 mM HEPES,0.8% w/v NaCl,pH 7.4)和硫酸銨((NH4)2SO4;240 mM,pH 5.4)。所有水溶液均通過0.22 μm聚醚砜注射器過濾器，然后注入SHM。

脂質混合物的乙醇溶液和水介質被注入到SHM中，其體積流速由兩個注射泵控制。實驗設置如圖1所示。對于由高熔點磷脂(DPPC和DSPC)組成的配方，使用加熱帶來保持乙醇和水溶液的溫度至少高于磷脂的凝膠到液態晶體相變溫度10°C(DPPC為51°C,DSPC為65°C)。從SHM的出口收集脂質體，在室溫下隔夜透析去除乙醇，對1 L用于制備的相同水介質，在不斷攪拌下，使用Pur-A-LyzerTM透析試劑盒。

表1：脂質配方的組成

圖1. 水介質對DOPC5大小和分散性的影響。在DW、NS和PBS中制備的10mM DOPC5的Z平均直徑和分散性，TFR為1和2 mL/min,FRR為1。實線和虛線(〇)分別表示脂質體Z平均直徑和分散性。數據代表至少三個獨立實驗的平均值±SD。與相同TFR的DW相比，所有均值之間的差異均以p < 0.05表示(LSD檢驗)。**，p < 0.01比較Z平均直徑。#，p < 0.05；##，p < 0.01；###，p < 0.001比較分散性。

圖2.TFR和FRR對DOPC5大小和分散性的影響。在(a)NS和(b)PBS中制備的10mM DOPC5的Z-平均直徑和分散性，TFR為1和2 mL/min,FRR為1、2、3和5。實線和虛線(〇)分別表示脂質體Z-平均直徑和分散性。數據代表至少三個獨立實驗的平均值±SD。所有均值之間的差異，p < 0.05表示(t檢驗)，比較TFR與相同的FRR。*，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.001比較Z-平均直徑。

圖3. 初始脂質濃度對DOPC5大小和分散性的影響。在NS和PBS中制備的5、10、15mM的DOPC5的Z平均直徑和分散性，TFR為2 mL/min,FRR為1。實線和虛線(〇)分別表示脂質體Z平均直徑和分散性。數據代表至少三個獨立實驗的平均值±SD。與10 mM相比，所有p < 0.05的均值差異均被標記(LSD檢驗)。#，p < 0.05；##，p < 0.01比較分散性。

圖4. FRR對DSPC5大小和分散性的影響。在NS或PBS中制備的10mM DSPC5的Z-平均直徑和分散性，TFR為2 mL/min,FRR為2、2.5、3和4。實線和虛線(〇)分別表示脂質體Z-平均直徑和分散性。數據代表至少三個獨立實驗的平均值±SD。

圖6. 磷脂剛性對脂質體大小和分散性的影響。在NS和PBS中制備的10mM DOPC5、DPPC5和DSPC5的Z平均直徑和分散性，TFR為2 mL/min,FRR為3。實線和虛線(〇)分別表示脂質體Z平均直徑和分散性。數據代表至少三個獨立實驗的平均值±SD。所有均值之間的差異，在相同的水介質中比較DSPC5,p < 0.05被標記(LSD檢驗)；*，p < 0.05；**，p < 0.01比較Z平均直徑。#，p < 0.05；##，p < 0.01；###，p < 0.001比較分散性。

表2：通過SHM裝置在不同水介質(NS, PBS (pH 7.4)， HBS (pH 7.4)， and (NH4)2SO4 (pH 5.4))中制備的用于穩定性研究的空間穩定脂質體配方的優化流動條件，相應的流體動力直徑和分散性(初始脂質濃度為10 mM)。數據代表至少三個獨立實驗的平均值±SD。

圖7. 微流控制備脂質體的結構闡釋。(a)DOPC5，(b)DSPC2.5，和(c)DPPC5的透射電子顯微鏡(TEM)圖像，它們各自的***佳流條件，如表2中所述。制備的脂質體具有直徑約100納米的水泡結構。比例尺為(a)200納米，(b,c)100納米。

我們系統地調查了所有可能影響空間穩定脂質體生產的因素。在此，我們提出了***個通用流程圖，作為定性建議，用于使用SHM微流控設計和優化空間穩定脂質體配方(圖2)。 該流程圖是基于每個參數對所制備脂質體的影響而安排的，并總結了改變加工和配方參數對所制備脂質體的大小和分散性的影響。我們已經表明，當我們用微流控優化配方時，我們希望按照向下的方向設計每個參數，并從加工參數開始優化每個參數。如果優化加工參數不能解決遇到的問題，我們必須按照向上的方向修改配方；在***壞的情況下，改變脂質組分。

我們的研究表明，通過控制加工和配方參數，所有三種PEG化配方都成功地制備了所需的尺寸(~100 nm)、分散性(< 0.2)和***終脂質濃度(7.5 mM)，與傳統薄膜水合擠出法制備的配方相當。透射電鏡證實了優化脂質體的囊泡結構。通過pH梯度將DOX遠程裝載到脂質體中進***步驗證了其膜完整性和作為藥物傳遞系統的能力。盡管DSPC5在分散性方面具有次優特性，但它也能保持pH梯度，并具有令人滿意的DOX封裝效率。此外，雖然不飽和DOPC5和飽和DPPC5配方可以通過改變加工參數(TFR和FRR)以相對簡單的方式制備，但無論加工參數如何，DSPC5都是分散的(分散性> 0.2)。通過優化配方參數，即DSPE-PEG2000的含量，制備了直徑小、分散性低的改良DSPC2.5配方。

(文章來源于儀器網)