超高效液相色譜-串聯質譜法同時快速檢測微量血清中6種脂溶性維生素
摘 要
正 文
維生素在人體生長代謝過程中發揮著重要作用，是人體必須的微量營養素，缺乏或過量都會對人體健康產生不利影響。維生素A、D、E是脂溶性維生素，研究表明缺乏這些維生素會增加患夜盲癥、骨質疏松、心血管疾病及免疫系統相關疾病的風險[1],嬰幼兒及未成年人缺乏其對生長發育的影響則更為明顯[2-4]。目前維生素檢測的方法主要有高效液相色譜法[5-7]、液相色譜-串聯質譜法[8-14]等，其中液相色譜-串聯質譜法因其靈敏度高、重現性好、可同時快速檢測多種維生素已成為很多臨床實驗室的***選方法。但是目前的液相色譜-串聯質譜方法血液需求量較大[10,13],檢測項目單***[8-9,14]或檢測時間較長[11],不能滿足臨床同時快速檢測多個項目的需求，特別是嬰幼兒采血困難采血量很難滿足需求。雖然已有部分學者建立微量檢測方法用于維生素檢測，但是這些方法需要衍生化過程，前處理復雜耗時較長[8-9,14]。因此，建立能夠用微量血液同時快速檢測多種維生素的方法滿足臨床不同年齡段的檢測需求顯得尤為必要。
此外，視黃醇，維生素D的代謝產物25-OH-VD2、25-OH-VD3,α-生育酚是脂溶性維生素A、D、E在血液循環中的主要存在形式，常作為脂溶性維生素檢測的***選指標[15-18]。γ-生育酚是維生素E主要的飲食攝入形式，但其與α-生育酚轉移蛋白(α-TTP)的親和力較低，在體內含量較α-生育酚低，但是，近年來文獻報道其在人體健康活動中也扮演著重要角色[19]。本文建立超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)同時快速檢測微量血清中視黃醇，維生素D(25-OH-VD2、25-OH-VD3)和α-、β-、γ-生育酚的方法，滿足臨床各年齡段尤其是對嬰幼兒同時快速檢測多種維生素的需求。
１實驗部分
１.１ 儀器與試劑
１.２ 標準溶液和內標溶液的配制
用無水乙醇配制視黃醇標準品儲備液100μg/mL；α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚標準品儲備液各1000μg/mL，并用紫外分光光度計對其濃度進行校正[18,20]。用甲醇配制25-OH-VD2標準品儲備液25μg/mL和25-OH-VD3標準品儲備液100μg/mL，視黃醇-d6標準品儲備液100μg/mL，25-OH-VD2-d3標準品儲備液50μg/mL，25-OH-VD3-d6標準品儲備液50μg/mL，α-生育酚-d6標準品儲備液1000μg/mL。
將各目標化合物標準儲備液用復溶液(初始流動相)稀釋混勻，配制成混合標準溶液(視黃醇2.50μg/mL、25-OH-VD2 0.20μg/mL、25-OH-VD3 0.40μg/mL、α-生育酚50.00μg/mL、β-生育酚5.00μg/mL、γ-生育酚 5.00μg/mL)；將各同位素標品儲備液用甲醇稀釋混勻，配制成混合內標工作液(視黃醇-d6 2.00μg/mL、25-OH-VD2-d3 0.10μg/mL、25-OH-VD3 0.20μg/mL、α-生育酚-d6 20.0μg/mL)。取4g BSA溶解于100mL水中配成4% BSA溶液。
１.３ 樣本前處理
取血清樣品20μL至2mL離心管中，加入10μL同位素內標工作液，80μL水，2000r/min渦旋振蕩30s后加入200μL甲醇-乙腈(50∶50,v/v)，2000r/min混勻60s；加入800μL正己烷，2000r/min，混勻5min，然后4℃，12000r/min離心5min；吸取600μL上清液至1.5mL離心管中，室溫下氮氣吹干；加100μL初始流動相復溶，渦旋振蕩60s，4℃，12000r/min離心5min，上清液轉移至進樣瓶中待分析。
１.４ 色譜 － 質譜條件
采用Phenomenex Kinetex F5(100mm × 2.1mm, 2.6μm)色譜柱，柱溫35℃，流動相A含2.5mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的水溶液；流動相B含2.5mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脫程序：0～2.0min，70%B，2.0～2.5min，70%～88% B，2.5～3.5min，88% B，3.5～3.51min，88%～81%B，3.51～11.0min，81% B，11.0～12.0min，81%～70%B，流速0.5mL/min。進樣量：20μL。
采用多反應監測(MRM)、電噴霧正離子模式(ESI+)，離子源溫度 150℃，脫溶劑溫度500℃，毛細管電壓3kV，脫溶劑氣流速1000L/h；6種脂溶性維生素的MRM 離子參數見表1。
２ 結果與討論
２.１ 前處理條件優化
２.２ 液 相 色 譜 條 件 優 化
Kinetex F5色譜柱可以實現所有組分包括β、γ-生育酚的分離。此外，25-OH-VD3同分異構體3-epi-25-OH-VD3在嬰幼兒體內含量較高，對維生素D含量測定影響較大[21]，該色譜柱可以實現25-OH-VD3和3-epi-25-OH-VD3的分離，減少3-epi-25-OH-VD3對檢測結果的影響。故采用Kinetex F5色譜柱進行所有組分的分離(見圖2)。研究發現在流動相中加入甲酸銨后其促進目標化合物離子化的效果較加入乙酸銨好，響應值增加明顯，故在水相和有機相中均加入2.5mmol/L甲酸銨。
２.３ 線性范圍、檢出限和定量限
２.４ 方法精密度
將低、中、高三個濃度標準品溶液加入4% BSA混合血清樣本經本法處理后進行檢測，每個濃度重復6次，連續檢測三天，計算日內精密度為0.9%～9.6%，日間精密度為3.0%～9.3%(見表3)。該方法同時測定6種脂溶性維生素的日內精密度和日間精密度均在15%以內，方法精密度滿足檢測需求。
２.５ 方法準確度
將低、中、高濃度的標準品溶液加入混合血清樣本中按本法進行前處理后進行檢測，每個濃度重復6次，計算加標回收率，3個水平的加標回收率為86.6%～107.7%，相對標準偏差(RSD)為1.46%～9.39%(見表4)。該方法加標回收率均在80%～120%以內，方法準確度高滿足檢測需求。
采用建立的UPLC-MS/MS方法對美*********標準技術研究所(NIST)制定的標準參照品SRM 968f進行檢測，每個水平重復2次取平均值，驗證方法準確度。結果表明，除25-OH-VD2含量較低未能檢出外，其它檢測結果與靶值偏差均在5%以內，該方法檢測結果準確可靠(表5)。
２.７ 實際樣品測定
使用本方法對17份健康兒童血液樣本進行檢測，其中視黃醇含量為0.22～0.43μg/mL，25-OH-VD2含量為未檢出～5.19ng/mL，25-OH-VD3含量為6.83～49.21ng/mL，α-生育酚含量為5.63～12.73μg/mL，β-生育酚含量為0.03～1.37μg/mL，γ-生育酚含量為0.11～1.68μg/mL。本法適用于微量臨床血液樣本6種脂溶性維生素的同時快速檢測。
３結 論
本研究建立了超高效液相色譜串聯質譜法同時測定微量血清樣本中多種脂溶性維生素的方法，并對前處理過程中的蛋白沉淀試劑、萃取液用量，復溶液等進行了優化，以減少色譜圖中噪音干擾，改善色譜峰形，提高檢測靈敏度。并比較了不同色譜柱對多種脂溶性維生素尤其是不同類型維生素E的分離效果，***終選擇Phenomenex Kinetex F5色譜柱，該色譜柱可以實現β-生育酚和γ-生育酚的有效分離。本研究中只需20μL血清就能夠快速完成6種脂溶性維生素的測定。該方法測定樣本需求量少、操作簡單、檢測結果準確快速可實現大量臨床樣本的同時檢測，尤其對采血較為困難的嬰幼兒可以實現少量血液樣本檢測多數項目的需求。
(文章來源于互聯網)
